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馬臟器組織NK細胞分離液試劑盒

Store at：：：RT 試劑盒規格：：：：3×100ml/Kit

試劑盒內容：

全血及組織稀釋液 100ml

細胞洗滌液 100ml

試劑 B 100ml

試劑 D 100ml

試劑 E 100ml

說明書 1 份

馬臟器組織NK細胞分離液試劑盒

1. 適用于各種動物血液及臟器組織本系列產品檢索

2. 相關試劑及耗材

3. 注意事項

4. 應用

5. 產品性能指標

6. 貯藏及保存期限

7. 實驗前準備

8. NK 細胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例

9. HES-TBD550 使用說明

10. 組織單細胞懸液的制備

11. 生產企業

12. 參考文獻

2. .. 注意事項 A． 本分離液是敏光型的，在運輸和貯藏過程中應在 18℃-25℃避光保存，啟封后置 4℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現白色結晶，影響分離效果。

B． 待分離的血液、組織及細胞要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一

定在20℃水浴箱中復溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時分離效果，

且所有操作過程一定要在無菌條件下進行。

C． 由于各品牌離心機的性能不同，國內南北地區溫度環境和四季的差異，可能影響

分離效果，用戶可以調節離心轉數，調節離心的時間，摸索*的分離條件（具體分離條件

各實驗室自定）。

D． 使用無靜電反應的離心管，推薦使用未經過堿處理的玻璃離心管。

E． *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素。應注意在血液稀釋過程中應去除抗凝劑

體積。

 F． 分離過程中所用其他試劑如：羥乙已基淀粉 550、全血及組織稀釋液、細胞洗滌液及

紅細胞裂解液等以我公司產品為*選擇，本公司相關系列產品無菌、無病毒、無支原體、

低內毒素水平且無細胞毒性，所獲得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態。

4. .. 應 4. 用

適用于從人或各種動物血液或臟器組織中分離 NK 細胞。

5.. . . 產品性能指標

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

內毒素 ≤0.5...EU/ml

無菌 直接接種培養 14 天后培養基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下

6.. . . 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限

18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置 4℃保存，有效期一周。

注：：：：若保證無微生物污染，啟封后可置 4℃長期保存。但應注意保存溫度較低時本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。

7. .. 實驗前準備 7. 實驗前準備

A． 試劑

NK 細胞分離液試劑盒所含試劑、組織勻漿液、胎牛血清

B． 器材 玻璃離心管、玻璃滴管 水平轉子離心機、無菌工作臺

A. 在 10ml 或 15ml 玻璃離心管中依次小心加入 B、D 兩種液體各 2ml,制成梯度界面（各液面分層一定要清晰）；

B．取 1ml新鮮抗凝血或組織單細胞懸液（細胞濃度為2×108

-1×109個/ml，具體制備方法參照“10.組織單細胞懸液的制備”）與試劑E 1：1混合后再按2:1的比例與全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）混勻。20℃-30℃靜置20-30分鐘，吸取上層渾濁液備用，棄去大部分紅細胞；

C．將步驟B中吸取的上層渾濁液小心加于D液之液面上；

D. 以400g（約1500轉/分）離心15分鐘(半徑15cm水平轉子)；

此時離心管中由上至下細胞分為四層。*層；為上清液層（包含血小板和血漿）。第

二層；；；；為 NK 細胞層。。。。第三層；為渾濁分離液層（含大量 T、B 及粒細胞）。第四層；為極少量紅細胞層。收集第二層 NK 細胞放入含 4-5ml 細胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉/分）離心 20 分鐘，棄去上清留沉淀細胞重新懸起。重復洗滌 2 次即得所需 NK 細胞。

注：：：：A. 提取率約為 80%。

 B．分離大量樣品時，具體操作方法請參照我公司“淋巴細胞快速分離技巧”，查詢路徑：

HES 是從支鏈淀粉衍生出來的，是富含淀粉的復合物，其生理和化學特性主要由羥乙已基

取代度即取代級、平均分子量決定。大量實驗表明平均分子量越大對紅細胞的凝集作用越強，

有效提高紅細胞的沉降速度，從而使紅細胞與其它細胞分離。故而，使用 HES-TBD550（羥

乙基淀粉 550）沉淀法是一種高效的細胞分離方法。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells ,MSCs) 是指一群可向成骨細胞、成脂肪細胞、

骨髓基質細胞、肝臟細胞、心肌細胞和神經細胞等多種細胞分化的多潛能組織干細胞,是在

細胞治療、基因治療中有效發揮作用的理想工程細胞。MSCs 不僅存在于骨髓,也可從臍血、

外周血中以及脂肪組織、肌肉、胎兒器官、大腦、牙齒中分離。UCB - MSCs 的分離、篩選、

增殖、分化與臍血樣本的選擇、培養基的差異以及分離、擴增分化過程中操作技術等多種因

素有關。目前用于 UCB - MSCs 分離的方法有:貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞儀

法和免疫磁珠法。流式細胞儀法對細胞損傷較大，免疫磁珠法價格相對較貴且由于抗原抗體

反應也容易改變細胞原有特性，而 HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯合密度梯度離心法常與貼壁篩選法結合使用,可提高所得 UCB - MSCs 的純度，目前研究多采用此法。國內不少學者采用羥乙已基淀粉沉淀紅細胞，然后再進行離心分離單個核細胞，也取得不錯結果。實驗證明采用隨機數字表法，將每份臍血隨機分入兩個不同處理組，從而將臍血樣本的個體差異減小到zui小程度。結果證實，HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯合密度梯度離心法獲得的有核細胞數量明顯多于 FICOLL 密度梯度離心法。本實驗采用的羥乙已基淀粉商品名為

HES-TBD550（羥乙已已基淀粉 550），克分子滲透壓為 308mosm／L，膠體滲透壓為 68／36 mmHg,可影響紅細胞集聚性沉降率。紅細胞集聚是可遞性橋接結構形成的結果，由大的 HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）分子處在紅細胞之間聯接而成。HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）同時還阻礙白細胞和內皮細胞的黏附，并使平均血小板容積呈現微弱地降低，從而有輕度抑制血小板集聚的功能。臍血經 HES-TBD550（羥乙一基淀粉 550）處理后，可使紅細胞沉積至試管底，對其它主要成分包括干細胞無影響。經這樣處理后，實驗時間相對較短（平均為 1.5 h），步驟相對較少，細胞污染幾率小，從而使細胞數損失減少。結論證明，與相應的干細胞分離液聯合分離使用羥乙已基淀粉沉淀法是一種高效的臍血干細胞分離方法。

10.. . . 組織單細胞懸液的制備

注：：：：A.. .. 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法，，，，酶消化法由于各實驗室選取的消化 酶消化法由于各實驗室選取的消化

酶種類各不相同，，，，請各實驗室自行選擇進行試驗 請各實驗室自行選擇進行試驗 請各實驗室自行選擇進行試驗。。。。

B. .. 全過程及所需試劑要求無菌環境 B. 全過程及所需試劑要求無菌環境 全過程及所需試劑要求無菌環境。。。。

剪碎法：：：：將組織塊放入平皿后，加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至

勻漿狀，加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用 100 目不銹鋼濾網

(另購)過濾到試管內；離心沉淀 1500轉/分×3 min，再用細胞洗滌液清洗 3次，每次以 500rpm

短時低速離心除去細胞碎片，以 200 目不銹鋼濾網（另購）過濾去細胞團塊。作細胞計數并

調整細胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用 20%胎牛血

清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108

-1×109個/ml 的單細胞懸液備用。

勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內，加入 2ml 組織勻漿液及 20% 勻漿器法

胎牛血清；緩慢轉動研棒，研磨至勻漿；用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器；收集

細胞懸液，經 200 目不銹鋼濾網（另購）過濾；離心沉淀 800rpm×2min ，再用細胞洗滌液

洗 3 次，離心沉淀。作細胞計數并調整細胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待測

細胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108

-1×109 個

/ml 的單細胞懸液備用。

細胞計數法是用來計數細胞懸液中細胞數量的一種方法。一般利用計數板（血球計數板）

進行。既可用于分離（散）細胞培養接種前計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，也可用于

對培養物的細胞數量進行計數。不論計數的對象如何，均須制備分散的細胞懸液。

計數與計算過程

1）、在細胞計數板中央放置計數的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側的計數板凹蹧處流出懸液，至

蓋玻片被液體充滿為止。

3）、置顯微鏡下計數四角大方格內的細胞總數。對于壓線的細胞只計數在上線和左線者，

對于細胞團按單個細胞計數。

4）、按下式計數細胞懸液的密度：

細胞密度＝（4 個大格細胞總數/4）×104個/ml×稀釋倍數

公式中乘以 104因為計數板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3

 而 1ml＝1000mm3

細胞計數要點： 細胞計數要點：：：

A． 進行細胞計數時，要求懸液中細胞數目不低于 104個/ml，如果細胞數目很少要進行離

心再懸浮于少量培養液中；顯微鏡下計數時，遇到 2 個以上細胞組成的細胞團，應按單個細

胞計算。如果細胞團>10％，說明細胞分散不充分; 或細胞數<200 個/10mm2或>500 個/10 mm2

時，說明稀釋不當，需重新制備細胞懸液。

B． 要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。

C． 取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其是多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混

勻，以求計數準確；

D． 數細胞的原則是只數完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細

胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。

E． 操作時，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。

初學者易犯的錯誤： 初學者易犯的錯誤：：：

A． 計數前未將待測懸液吹打均勻。

B． 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。

C． 滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

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